合作單位：丹麥奧胡斯大學(xué)

文章標(biāo)題：Metabolic Communication by SGLT2 Inhibition

期刊名稱：Circulation

影響因子：37.8

研究對(duì)象：小鼠、臨床隊(duì)列

測(cè)序技術(shù)：宏基因組測(cè)序、代謝組檢測(cè)。

百邁客生物為該研究提供了宏基因組測(cè)序服務(wù)。

 

研究背景

鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（SGLT2）主要在腎臟近曲小管S1段表達(dá)，負(fù)責(zé)對(duì)葡萄糖進(jìn)行定量重吸收。SGLT2 抑制劑（SGLT2i）是治療高血糖的有效療法，在2型糖尿病患者中，還可以保護(hù)心臟和腎臟免于衰竭。SGLT2i被認(rèn)為具有許多作用和多效機(jī)制，涵蓋增強(qiáng)生酮和類禁食代謝反應(yīng)、腎臟和全身血流動(dòng)力學(xué)效應(yīng)。然而，目前還未有研究闡明SGLT2i保護(hù)心血管和腎臟的關(guān)鍵機(jī)制，該機(jī)制對(duì)于心血管和腎臟保護(hù)至關(guān)重要。

丹麥奧胡斯大學(xué)學(xué)者在Circulation雜志上發(fā)表題為“Metabolic Communication by SGLT2 Inhibition“研究論文，研究團(tuán)隊(duì)使用Akita小鼠模型和臨床隊(duì)列樣品，通過(guò)整合宏基因組、代謝組、蛋白組等多組學(xué)數(shù)據(jù)，確定了SGLT2i對(duì)腎臟、心臟、血管和其他器官的幾種SGLT2依賴性效應(yīng)和脫靶效應(yīng)，通過(guò)重構(gòu)腎臟代謝物轉(zhuǎn)運(yùn)和全身代謝通訊，發(fā)揮心腎保護(hù)作用。提供了關(guān)于SGLT2相互作用因子和SGLT2i依賴性蛋白質(zhì)組、代謝組、磷酸化蛋白質(zhì)組和宏蛋白質(zhì)組的新見(jiàn)解，從而為SGLT2i新型和早期機(jī)制靶標(biāo)提供了潛在的路線，促進(jìn)代謝藥物的開(kāi)發(fā)。

材料方法

小鼠SGLT2i處理

19 只 8 周齡 C57BL/6J 雄性小鼠和 16 只糖尿病 C56BL/6-Ins2Akita/J 雄性小鼠，然后給予WD4周，WD后1周添加達(dá)格列凈或驅(qū)避WD飲食（vehicle；WT，n=9；Akita，n=8）。

組學(xué)技術(shù)

盲腸糞便宏基因組學(xué)和宏蛋白質(zhì)組學(xué)

腎組織、尿液、血漿非靶向代謝組

腎臟、肝臟、心臟、肌肉和白色脂肪組織蛋白質(zhì)組

研究結(jié)果

1、綜合組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)和翻譯策略概述

該研究旨在闡明SGLT2i的生理機(jī)制。作者假設(shè)大量的代謝器官通訊是對(duì)SGLT2i的反應(yīng)而發(fā)生的，因此選擇了綜合組學(xué)方法。對(duì)非糖尿病小鼠的所有主要代謝器官、生物體液和腸道微生物群以及Akita小鼠單純性高血糖的早期階段進(jìn)行了綜合代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析，Akita鼠是1型糖尿病的遺傳小鼠模型，長(zhǎng)期SGLT2i處理對(duì)其有改善作用（圖1A 和1B）。研究短期暴露于SGLT2i 1周，目的是確定主要代謝效應(yīng)和可能建立保護(hù)作用的代謝通訊，而不是研究長(zhǎng)期治療后器官功能改善的后果。選擇高脂肪西方飲食（WD）是為了模仿西方生活方式的代謝環(huán)境。選擇達(dá)格列凈是因?yàn)槠鋵?duì)患有和不患有糖尿病的患者具有心臟保護(hù)和腎臟保護(hù)特性。作者通過(guò)研究分析發(fā)現(xiàn)了一些意想不到的代謝信號(hào)（圖1C）。在后續(xù)研究中，將人腸道微生物培養(yǎng)物暴露于SGLT2i，使用SGLT2敲除 (KO) 小鼠來(lái)探測(cè)SGLT2i的脫靶效應(yīng)，并在人腎、患者血漿和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (hiPSC) 中進(jìn)行翻譯驗(yàn)證。同時(shí)在人腎、患者血漿和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 （hiPSC）中進(jìn)行驗(yàn)證（圖1D）。所得數(shù)據(jù)提供了關(guān)于SGLT2相互作用因子和SGLT2i依賴性蛋白質(zhì)組、代謝組、磷酸化蛋白質(zhì)組和元蛋白質(zhì)組的新見(jiàn)解，從而揭示了SGLT2i的下游通路，這也為代謝性疾病藥物的開(kāi)發(fā)提供了新思路。

2、匹配綜合有機(jī)組學(xué)發(fā)現(xiàn)和翻譯策略概述

使用達(dá)格列凈或溶劑對(duì)照一周后，對(duì)同一動(dòng)物的主要代謝器官的蛋白質(zhì)組學(xué)、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)和宏蛋白質(zhì)組學(xué)方法進(jìn)行了深度多組學(xué)分析（圖1A和1B）。結(jié)果表明，達(dá)格列凈可降低Akita小鼠的血漿葡萄糖水平，但不會(huì)降低非糖尿病WT小鼠的血漿葡萄糖水平。達(dá)格列凈在WT小鼠中誘導(dǎo)糖尿，但在Akita小鼠中沒(méi)有觀察到明顯的進(jìn)一步增加（圖S1A）。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)，在腎臟、肝臟、心臟、肌肉和白色脂肪組織中總共鑒定到9501個(gè)蛋白質(zhì)（8421個(gè)基因）和10744個(gè)磷酸化位點(diǎn)。其中，大多數(shù)SGLT2i引起的顯著變化是在腎臟中觀察到的。

3、SGLT2抑制對(duì)腎臟蛋白質(zhì)組的重新配置

定量了腎皮質(zhì)中的6676種蛋白質(zhì)，其中在WT組鑒定到6107種蛋白質(zhì)，Akita小鼠鑒定到6207種蛋白質(zhì)。分析表明，SGLT2i對(duì)腎臟蛋白質(zhì)組的影響比糖尿病小鼠更強(qiáng)：在WT小鼠中，SGLT2i增加了455種蛋白質(zhì)，減少了485種蛋白質(zhì)(圖2A)。SGLT2i治療糖尿病小鼠的蛋白質(zhì)變化較少(29個(gè)增加，53個(gè)減少)。兩組小鼠腎臟線粒體蛋白豐度均有顯著變化，但只有WT組小鼠體內(nèi)線粒體膜蛋白顯著上調(diào)(圖S2A)。此外，只有WT小鼠對(duì)SGLT2i有反應(yīng)，腎臟頂端或基側(cè)膜上的蛋白質(zhì)(圖2B)或參與mRNA剪接的蛋白質(zhì)下調(diào)。在WT小鼠中觀察到的更強(qiáng)烈的變化之后，GO富集分析表明，跨各種功能相互連接的蛋白質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生了一致的變化，大多數(shù)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在WT小鼠中被SGLT2i下調(diào)。

4、SGLT2i降低血漿腸源性有機(jī)陰離子(尿毒癥毒素)水平，盡管腎臟分泌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)降低

為了確定除了葡萄糖之外的其他代謝信號(hào)通路是否影響了整體代謝譜，作者在選定的器官和生物體液中進(jìn)行了非靶向代謝組學(xué)分析，總共有186種代謝物發(fā)生了顯著變化（所有器官總計(jì)322種）。作者發(fā)現(xiàn)SGLT2i主要影響尿液和血漿中代謝物的豐度，并且與糖尿病小鼠相比，非糖尿病小鼠受影響的分子多樣性更廣泛（圖3A）。

SGLT2抑制劑（SGLT2i）改變了腎蛋白質(zhì)組和磷酸蛋白質(zhì)組，同時(shí)調(diào)控其他代謝物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。其抑制作用引起了血漿和尿液代謝物的顯著變化。因此，研究者提出腎蛋白質(zhì)組的重編程可能部分解釋了觀察到的代謝物變化。文章中指出了可能影響體液循環(huán)代謝物組成的多個(gè)過(guò)程，包括尿液排泄的改變（圖3B）。在WT小鼠中，SGLT2i在腎臟中減少了27種SLC的表達(dá)。結(jié)合這些結(jié)果和尿液代謝譜，表明了SGLT2i可能通過(guò)影響其他器官的代謝物組成，從而導(dǎo)致尿液中代謝物的變化（圖3C）。

接下來(lái)，作者分析了血漿和尿液中代謝物的含量，這些代謝物可以反映對(duì)腎臟轉(zhuǎn)運(yùn)的主要影響。正如預(yù)期的那樣，葡萄糖和多種其他糖代謝物的血漿：尿液比率下降（圖3D），可能是因?yàn)槟I小管重吸收減少。血漿：尿液比率增加的代謝物是賴氨酸代謝物，包括二氨基庚二酸、三甲基賴氨酸、哌可酸和氨基己二酸，一種針對(duì)小鼠模型中肥胖和糖尿病的保護(hù)性代謝物。許多響應(yīng)SGLT2i而增加血漿：尿液比率的化合物是近端腎小管有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OAT1的底物（圖3D）：其中包括乙酰半胱氨酸、瓜氨酸、葡萄糖酸鹽和蛋氨酸， 表明這些化合物的腎臟分泌可能會(huì)減少。蛋白質(zhì)組分析結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)，即SGLT2i降低了WT中OAT1和OAT3的表達(dá)，腎膜組分的免疫印跡分析證實(shí)了這一點(diǎn)（圖3E）。與此同時(shí)，觀察到SGLT2i降低了所謂的滯留毒素或尿毒癥毒素的血漿水平（圖3A）。為了證實(shí)這一發(fā)現(xiàn)，對(duì)已知在腎臟疾病中保留且主要由腸道微生物組產(chǎn)生的血清代謝物進(jìn)行了針對(duì)性分析。SGLT2i減少了 WT 小鼠血漿中的許多尿毒癥毒素，包括PCL、ILA、鄰氨基苯甲酸、香草酸和3-吲哚基硫酸鹽（圖3F）。在獨(dú)立的非糖尿病動(dòng)物模型（高血壓Dahl SS大鼠）中，SGLT2i 同樣顯著降低了PCL硫酸鹽和ILA：尿液比率（圖S4E）。如前所述，這不能通過(guò)腎尿毒癥毒素 (OAT1/OAT3) 分泌能力的下調(diào)來(lái)解釋，并且表明SGLT2i改變了這些化合物的形成。

5、SGLT2i重組尿毒癥毒素氨基酸腸道菌群發(fā)酵

許多尿毒癥毒素是由菌群產(chǎn)生的，SGLT2i改變尿毒癥毒素的代謝物，主要來(lái)自苯丙氨酸和色氨酸。因此，作者假設(shè)SGLT2i影響菌群，從而改變這些代謝物的產(chǎn)生。為了檢驗(yàn)這一假設(shè)，使用宏基因組輔助宏蛋白質(zhì)組學(xué)分析了匹配的盲腸微生物組（圖 S6A）。通過(guò)宏基因組學(xué)總共發(fā)現(xiàn)了6899個(gè)物種。將其轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)組，定量了這些物種的14621個(gè)蛋白質(zhì)（WT為8249個(gè)，Akita小鼠為10847個(gè)），與Akita小鼠相比，SGLT2i在WT中的作用更強(qiáng)。系統(tǒng)發(fā)育概述總結(jié)了SGLT2i在WT小鼠中從門(mén)到科水平對(duì)微生物群的重新配置（圖4A）。在屬水平上，SGLT2i促使Akkermansia 和Lachnoclostridium增加，Acetatifactor和Bilophila減少（圖S6B）。

宏蛋白質(zhì)組的多樣性分析顯示，治療后糖尿病小鼠的α多樣性較高，而WT和糖尿病小鼠的對(duì)照和治療動(dòng)物的β多樣性顯著不同。宏蛋白質(zhì)組分析還涵蓋了消化道的典型蛋白質(zhì)，其中大多數(shù)蛋白質(zhì)被SGLT2i 下調(diào)，34個(gè)下調(diào)，3個(gè)上調(diào)。與腎臟一樣，一些減少的蛋白質(zhì)參與營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)，包括寡肽的Slc15a1、尿酸鹽/外源性分泌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 Abcg2和脂肪酸輸入的Slc27a4。

由于WT小鼠中SGLT2i改變的許多血漿溶質(zhì)是芳香族氨基酸的代謝物，因此分析了可以在蛋白質(zhì)組水平上代謝這些氨基酸的細(xì)菌的豐度。對(duì)于產(chǎn)生吲哚的細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)表達(dá)色氨酸酶以從色氨酸產(chǎn)生吲哚的物種減少（吲哚丙烯酸；圖4B）。

使用苯丙氨酸等芳香族氨基酸作為底物可以減少甲酚和苯酚的生成劑（圖4B）。糞便代謝組檢測(cè)表明顯示糞便中存在達(dá)格列凈（圖4C）。在達(dá)格列凈治療小鼠的這些糞便樣本中，色氨酸和苯丙氨酸發(fā)酵的代謝物有所減少（圖4C）。為了探究達(dá)格列凈在糞便中的直接作用，將SGLT2i添加到人糞便中。厭氧發(fā)酵后，發(fā)現(xiàn)吲哚乳酸、色氨酸代謝物和肉桂酰甘氨酸減少（圖4D）；也就是說(shuō)，與WT小鼠血漿中SGLT2i 減少的化合物相關(guān)的化合物（圖3F）。在人體糞便發(fā)酵中添加SGLT2i也逆轉(zhuǎn)了這些毒素母體分子的消失，特別是芳香族氨基酸色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸（圖4D）。

這表明SGLT2i對(duì)微生物群產(chǎn)生較少尿毒癥毒素的生理作用也可能涉及SGLT2i對(duì)微生物群的直接影響。

6、SGLT2I對(duì)尿毒癥毒素代謝產(chǎn)物的凈減少不依賴SGLT2

作者進(jìn)一步檢測(cè)了還原的代謝物是否獨(dú)立于SGLT2蛋白的存在，以及這些影響是否在更長(zhǎng)的時(shí)期內(nèi)保持。使用了SGLT2 KO小鼠模型（SGLT2 KO）。用SGLT2I（達(dá)格列凈）對(duì)SGLT2 KO和WT小鼠進(jìn)行了16周的正常飲食治療，分析了血漿和尿液，并使用保留代謝物小組進(jìn)行了血漿靶向分析(圖5A)。SGLT2 KO小鼠的血糖較低，葡萄糖排泄量較高，食物攝入量較高(圖5B和圖S6E)。在KO小鼠中，SGLT2i不影響這些措施中的任何一項(xiàng)。

在SGLT2 KO和WT小鼠中，許多代謝物的比率發(fā)生了類似的變化，就像在WT小鼠中使用達(dá)格列凈和溶劑處理一樣(圖5C左圖)，這表明SGLT2抑制的后果。在其他方面，葡萄糖比率的下降，反映了尿糖排泄的增加。正如預(yù)期的那樣，SGLT2的缺失阻斷了達(dá)格列凈對(duì)葡萄糖排泄的影響(圖5C右圖)。另一方面，達(dá)格列凈顯著改變了SGLT2 KO小鼠體內(nèi)許多代謝物的比例，表明了一種偏離靶點(diǎn)的效應(yīng)(圖5D)。血漿：尿液比例的排名變化顯示，達(dá)格列凈降低了SGLT2 KO小鼠中多種芳香酸代謝物的比例，包括甲酚和馬尿酸鹽，其次是色氨酸代謝物。血漿水平分析確定了SGLT2i在SGLT2 KO環(huán)境中顯著改變的5種代謝物，包括PCL硫酸鹽和一種修飾的馬尿酸(圖5E和5F)。該實(shí)驗(yàn)表明SGLT2i治療具有非靶點(diǎn)效應(yīng)，包括對(duì)甲酚、馬尿酸鹽和色氨酸代謝物。

7、SGLT2i的代謝器官通訊效應(yīng)在人類中是相關(guān)的

鑒于腎臟SGLT2相互作用組以及微生物對(duì)SGLT2i的反應(yīng)在小鼠和人類中相似，我們想知道SGLT2i是否會(huì)影響循環(huán)中的溶質(zhì)，在縱向數(shù)據(jù)中與心血管相關(guān)。對(duì)來(lái)自2個(gè)獨(dú)立研究的患者的血漿樣本進(jìn)行了靶向代謝組分析，目標(biāo)是80個(gè)有機(jī)陰離子和尿毒癥毒素。在第一組>40名患者中，在失代償性心衰的真實(shí)環(huán)境中分析了這種影響(圖6A)。結(jié)果表明，SGLT2i顯著降低或鈍化了心力衰竭患者血漿中幾種有機(jī)陰離子的增加，但僅當(dāng)住院期間添加SGLT2i時(shí)(圖6B和6C)。包括幾種色氨酸代謝物，如ILA、犬尿酸和乙酰色氨酸，以及苯丙氨酸代謝物苯乙酰谷氨酰胺和PCL硫酸鹽。分析了在糖尿病患者中使用SGLT2I(依帕列凈)的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)的縱向數(shù)據(jù)(圖6D)。與基線和安慰劑相比，二甲基尿酸和三甲基尿酸的血漿濃度降低，PCL降低，吲哚代謝物增加緩慢(圖6E和6F)。在兩項(xiàng)臨床研究中，降低的溶質(zhì)大部分來(lái)自嘌呤代謝和腸道芳香氨基酸代謝，這與在小鼠身上觀察到的代謝器官一致。

8、SGLT2i依賴代謝物對(duì)甲酚誘導(dǎo)人EHT應(yīng)激信號(hào)

在人類、小鼠（包括Sglt2 KO小鼠）和大鼠研究中的不同循環(huán)代謝物之間觀察到一致的總體趨勢(shì)（圖7A），在觀察到的所有系統(tǒng)中，SGLT2i均一致降低PCL硫酸鹽或 PCL。為了分析這種化合物對(duì)人體組織的影響，將hiPSC EHT暴露于PCL。PCL在先前報(bào)道的患者濃度（300 μM）68,69 下改變了心肌細(xì)胞的松弛時(shí)間（圖7B）。數(shù)小時(shí)內(nèi)濃度提高十倍（低mM 范圍）顯著降低了力和頻率（圖7C和圖S7A），當(dāng) EHT 受到頻率控制時(shí)也是如此（圖S7B）。PCL 對(duì) EHT 的影響是部分可逆的，可以通過(guò)洗掉化合物來(lái)恢復(fù)（圖7C ）。

為了進(jìn)一步闡明該機(jī)制，對(duì)用300μM PCL、吲哚乳酸和3種其他芳香族代謝物處理的 EHT 組織進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析（圖7D）。觀察到最強(qiáng)烈的變化是 PCL 的反應(yīng)（圖7D）。多種蛋白質(zhì)的增加包括心臟病相關(guān)通道TRPM4、 FLNA和生長(zhǎng)因子CCN1；減少的蛋白質(zhì)包括 PPP1R1A，其下調(diào)已被報(bào)道為人類HF的標(biāo)志。PCL改變的蛋白質(zhì)組的一個(gè)獨(dú)特特征是心臟肌節(jié)相關(guān)蛋白的減少（圖S7D），以及應(yīng)激信號(hào) GDF15的強(qiáng)烈感應(yīng)（圖7E）。考慮到HF患者中該通路的調(diào)節(jié)，檢測(cè)了GDF15 水平，發(fā)現(xiàn)接受SGLT2i治療心力衰竭的患者循環(huán) GDF15 減少（圖7F）。

研究總結(jié)

該研究通過(guò)整合多個(gè)代謝器官和體液樣品，進(jìn)行了深入的蛋白質(zhì)組學(xué)、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)SGLT2i減少了尿毒癥毒素（如對(duì)甲酚硫酸鹽）的微生物群形成，從而減少了它們的體內(nèi)暴露和腎臟解毒的需要，結(jié)合SGLT2i對(duì)腎臟的直接影響，包括較少的近端小管葡萄糖毒性和對(duì)頂端轉(zhuǎn)運(yùn)體（包括鈉、氨基酸和尿酸鹽的攝?。┑膹V泛下調(diào)，為腎臟和心血管保護(hù)提供了代謝基礎(chǔ)。該研究提供的資源為更深入地了解SGLT2抑制劑對(duì)代謝、腎臟和心臟功能的影響，從而對(duì)維持心血管健康提供了新的見(jiàn)解。