英文題目：GmST1, which encodes a sulfotransferase, confers resistance to soybean mosaic?virus strains G2 and G3
中文題目：GmST1, 編碼磺基轉移酶, 賦予對大豆花葉病毒G2和G3株的抗性發(fā)表
期刊：Plant, Cell& Environment
影響因子：6.059
合作單位：東北農業(yè)大學大豆生物學教育部重點實驗室/農業(yè)農村部東北大豆生物學與遺傳育種重點實驗室
研究背景
大豆[Glycine max（L.）Merr。]是一種在世界范圍內種植的重要油料作物，是人類豐富的植物油和蛋白質來源。但許多病原體優(yōu)先攻擊大豆。這些攻擊導致嚴重的產量損失和質量下降。在全世界攻擊大豆的病原體中，大豆花葉病毒（SMV）是通過蚜蟲和感染的種子非持久性傳播的，是最廣泛和破壞性最大的疾病之一。SMV感染通常會使大豆產量降低10–30％，但在嚴重暴發(fā)時，損失可能達到50–100％。根據大豆品種中SMV感染的癥狀，包括典型的葉片圖案，葉片變形，植物發(fā)育不良，頂部壞死和種子斑點，將SMV菌株分為7種主要致病型：G1-G7。由于種子的可傳播性，所有主要大豆生產國都存在菌株致病型（G1-G7）。目前，有4個主要的SMV抗性基因座（Rsv1，Rsv3，Rsv4和Rsv5），大豆基因組的可用性加快了分子標記的開發(fā)和Rsv基因座候選基因的鑒定。最主要的Rsv1基因座是最復雜的，它包含編碼NBS-LRR蛋白的基因簇，這個染色體區(qū)域還攜帶多種病原體抗性基因，一大類同源NBS-LRR序列聚集在Rsv1基因座上，據推測，DNA的兩個片段分別是3gG2（Glyma.13g190800的等位基因）和5gG3（Glyma.13g190000的等位基因），是Rsv1的最可能的候選基因，針對Rsv3，Rsv4也進行了相關的研究。盡管針對每個Rsv基因座篩選了候選基因，但除了Rsv4以外，沒有一個關鍵基因被完全闡明。本研究中使用重組自交系RIL群體和F2分離群體，確定并精細繪制了SMV抗性基因座Rsvg2；分離候選基因的同時，使用表達分析和遺傳轉化測定法驗證了其功能。最終發(fā)現(xiàn)，Rsvg2編碼磺基轉移酶（SOT），GmST1，與AtSOT15（AT5G07010）同源，為大豆對SMV的抗性提供了新的可能解釋。
研究材料
352份栽培大豆種質材料，GWAS全基因組關聯(lián)分析；
130份 F8:9?RIL群體材料（Dongnong93-046與Hefeng25作親本雜交獲得；Dongnong93-046，對SMV strains G2和G3抗性材料/Hefeng25，對strains G2和G3感性材料），構建極端混池（SMV-resistant and-susceptible gene pools, consisting of 30 lines each），BSA分析；
130份RIL群體材料，鑒定由GWAS和BSA聯(lián)合定位并賦予SMV抗性的基因座；
1500份F2群體材料（Dongnong93-046和Hefeng25做親本雜交獲得），QTL分析；
Hefeng25，對SMV菌株G2和G3敏感的親本株系，作為轉基因受體；
上述大豆材料生長于溫度25–26°C，光照周期16 h光照/ 8 h黑暗，相對濕度75％的溫室，進行了人工SMV接種。
研究方法
大豆種質材料基因分型：SLAF-seq簡化基因組測序；
大豆對SMV菌株G2的抗性初定位：GWAS分析（CMLM模型）；
抗性Rsvg2基因共定位：BSA和SLAF-seq關聯(lián)分析；
抗性Rsvg2基因精細定位：Rsvg2區(qū)域遺傳圖譜構建，QTL定位；
GmST1序列變異鑒定與分析：PCR；
SOT酶活測定：ELISA；
GmST1候選基因的克隆與大豆遺傳轉化：GmST1?P
圖1 Rsvg2基因座的精準定位
4.?GmST1基因的多態(tài)性與SMV抗性相關
通過對22個大豆品系（包括10個抗SMV種質號和12個SMV易感種質）的GmST1基因序列分析，在GmST1基因的編碼序列中鑒定出4個SNPs：兩個同義和兩個非同義（圖1），而所有SNP都位于SOT結構域中，最終，由22個大豆品系中的4個SNP定義了6個GmST1單倍型，抗SMV品系由2種單倍型代表，而易感SMV品系由4種單倍型代表。針對BSA極端混池中每個個體中的GmST1序列進行比對分析，發(fā)現(xiàn)30個SMV抗性株中的GmST1序列與東農Dongnong93-046中的GmST1序列相同，而30個SMV感性株中的GmST1序列與和Hefeng25中的GmST1序列相同。GmST1編碼序列第506位的2個SNP等位基因已通過SMV抗性進行明確劃分，重組株序列分析表明：506位的TT等位基因對SMV G2菌株的抗性是必需的，將506位的TT [編碼苯丙氨酸（Phe）]和CC [編碼絲氨酸]等位基因分別命名為RSVG2-R和RSVG2-S（圖1）。對75個大豆種質的進一步基因分型表明，所有7份抗SMV的種質均在GmST1的506位攜帶RSVG2-R等位基因，而其余68份對SMV敏感的種質均攜帶RSVG2-S等位基因。最后針對GmST1基因編碼蛋白質的二級結構及SOT酶活性進行分析。這些結果表明，GmST1基因位于Rsvg2基因座，并且SMV的感染誘導了GmST1介導的SMV抗性。
5.?GmST1的轉錄表達模式
通過qRT-PCR和RNA-seq對SMV抗性株系 Dongnong93-046和SMV-感性株系Hefeng25的不同組織進行分析，分析結果表明，GmST1基因受SMV感染調控，且該基因在抗SMV和易感SMV大豆品種之間存在差異表達(圖2)。由抗性基因介導的乙烯，水楊酸（SA）和茉莉酸（JA）等防御反應相關激素在不同植株中存在差異，研究結果發(fā)現(xiàn)：GmST1基因編碼SOT，12-OH-JA在茉莉酸代謝途徑中起作用，是SOT的直接底物。進一步研究表明GmST1基因可能參與了JA代謝途徑，因此，RSVG2-R等位基因對SMV G2菌株的抗性可能取決于茉莉酸代謝途徑。
圖2 GmST1基因在抗SMV的Dongon93-046和SMV感的Hefeng25中的相對表達
圖3 T2轉基因植株（2-11、2-18和2-47）和非轉基因植株“Hefeng25”在感染后表型
6. GmST1的過表達增強了大豆對SMV的抗性
為了測試過表達GmST1 RSVG2-R等位基因的過表達是否會增強轉基因植物中SMV抗性，本研究進行了轉基因過表達實驗。使用農桿菌介導的轉化方法獲得了3株獨立的T1轉基因大豆植物。第一次接種SMV G2和G3菌株3周后，非轉基因大豆植物的葉片比3種T2轉基因植物的葉片表現(xiàn)出更典型的鑲嵌癥狀（圖3）。在15 dpi時，發(fā)現(xiàn)3種轉基因植物中GmST1的相對表達水平顯著高于非轉基因植物，進一步推測GmST1的RSVG2-R等位基因提升了大豆對SMV G2和G3菌株的抗性。同時在對SMV外殼蛋白（CP）基因表達的qRT-PCR定量顯示，在非轉基因（對照）大豆植物中CP較高，GmST1的表達水平相對較低。
7.?GmST1介導的大豆抗SMV的相關途徑
研究中為了證明在RSVG2-S等位基因和RSVG2-R等位基因之間，GmST1對SMV應答的功能機制有所不同，且可能與JA信號通路相關（圖4），進一步關注了RSVG2-R等位基因攜帶者（Dongnong93-046與轉基因株系OE2-18）和RSVG2-S等位基因載體（Hefeng25）JA含量的轉錄本的變化，結果表明，內源性JA對SMV G2菌株有響應，且響應程度在GmST1的不同單倍型之間發(fā)生變化。最后基于RNA-seq數(shù)據，通過轉基因與非轉基因植株的比對，對JA信號通路相關基因進行研究，結果表明，在SMV G2菌株感染下，JA的合成和代謝在RSVG2-R等位基因攜帶者中比在RSVG2-S等位基因攜帶者中更活躍，作為JA信號傳導途徑中的受體蛋白編碼基因，JAZ在具有不同GmST1等位基因的大豆品系之間具有差異表達，說明JA途徑是由SMV感染誘導的，且GmST1介導的SMV抗性可能取決于JA防御反應。
京公網安備 11011302003368號