1、提取方法

1)植物多組學(xué)產(chǎn)品組織細(xì)胞：Small RNA提取試劑盒，判定時(shí)結(jié)合其他產(chǎn)品的總RNA核酸判定

2)植物SRNA產(chǎn)品，艾德萊RN40（廠家：艾德萊，型號(hào)：RN40））試劑盒

3)動(dòng)物（非昆蟲）：TRIzol

2、檢測(cè)方法

2.1檢測(cè)方法

使用 Nanodrop2000 （廠家：賽默飛,型號(hào)： Nanodrop2000）對(duì)于提取的核酸進(jìn)行濃度純度檢測(cè)，并使用LabChip GX（廠家：鉑金埃爾默，型號(hào)：LabChip GX Touch HT）對(duì)完整性進(jìn)行檢測(cè)

2.2判定標(biāo)準(zhǔn)

2.2.1Small RNA提取試劑盒判定標(biāo)準(zhǔn)

1)總量≥0.4（ug），滿足 2 次建庫

2)濃度≥20（ng/ul）

3)體積≥10(ul)

4)OD260/280 在 1.7-2.5 之間，OD260/230 在 0.5-2.5 之間，260nm 吸收峰顯示正常

5)需結(jié)合峰圖判斷，是否有5s峰，以及其他產(chǎn)品是否有降解

6)樣本狀態(tài)正常，樣本粘稠、顏色異常、有渾濁或不溶物均不合格

2.2.2艾德萊RN40、TRIzol

7)總量≥1（ug），滿足 2 次建庫

8)濃度≥80（ng/ul）

9)體積≥10(ul)

10)OD260/280 在 1.7-2.5 之間，OD260/230 在 0.5-2.5 之間，260nm 吸收峰顯示正常

11)RIN 值≥6.0（非植物），RIN 值≥6.0（植物）需結(jié)合基線判斷，28S/18S≥1 且基線無上抬或輕微上抬

12)樣本狀態(tài)正常，樣本粘稠、顏色異常、有渾濁或不溶物均不合格

3、樣本狀態(tài)

樣本狀態(tài)正常，樣本粘稠、顏色異常、有渾濁或不溶物均不合格建庫方法

3.1連接3’接頭

向準(zhǔn)備好的RNA中加入3′ Adapter，混勻瞬離后PCR儀70℃加熱2min預(yù)變性，然后加入RL3 Buffer及RL3 Enzyme Mix，混勻離心后，金屬浴孵育進(jìn)行連接接頭反應(yīng)

3.2反轉(zhuǎn)錄引物退火

向上步反應(yīng)的離心管中加入RT Primer，混勻離心后，放入PCR儀中設(shè)定好的程序進(jìn)行退火反應(yīng)

3.3連接5’接頭

向上步反應(yīng)的離心管中加入RL5 Adapter（70℃加熱2min進(jìn)行變性后使用）、RL5 Buffer及RL5 Enzyme Mix，混勻離心后，金屬浴孵育進(jìn)行連接接頭反應(yīng)

3.4反轉(zhuǎn)錄

向上步反應(yīng)的離心管中加入RT buffer、RT Enzyme mix，混勻離心后，放入PCR儀中設(shè)定好的程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

3.5PCR 擴(kuò)增

向上述反應(yīng)產(chǎn)物中依次加入Amplification Mix、Universal Primer（10μM）和IndexX Primer*（10μM），混勻離心后，放入PCR儀中設(shè)定好的程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

注意：IndexX Primer*中包含Index序列，使用時(shí)需嚴(yán)格按照上機(jī)調(diào)度安排的序列添加

3.6PCR 產(chǎn)物純化

1)瞬時(shí)離心 PCR 反應(yīng)管，加入相應(yīng)體積的磁珠，充分混勻

2)室溫孵育，然后置于磁力架上靜置，小心移除上清液

3)向反應(yīng)管中加入新鮮配制的 80% ethanol ，磁力架上靜置 30s ，移棄上清液，重復(fù)該步驟 1 次

4)打開管蓋，磁珠干燥后加入 Nuclease-free Water 洗脫 DNA ，吹吸混勻，室溫靜置，磁力架上靜置，小心 吸取上清至新的離心管中，并分裝 1.5 μL 于新的 1.5 mL 離心管中用于片段檢測(cè)，-20℃保存

3.7PAGE凝膠電泳和切膠

1)向PCR純化產(chǎn)物中加入10μL 6×Gel Loading dye，輕彈混勻，避免出現(xiàn)氣泡

2)取一板6% TBE Gel（1.0mm×10well）膠板放入電泳槽中，倒入TBE緩沖液后，點(diǎn)入marker和樣品

3)蓋上電泳槽蓋，在指定電壓下開始電泳，電泳結(jié)束后，取出膠放入EB染色液中進(jìn)行染色

4)染色結(jié)束后，在紫外燈下照相保存

5)紫外燈下用刀片切取指定范圍的條帶，并放入離心管中進(jìn)行保存

3.8膠回收

1)將膠塊在離心機(jī)的高速離心力作用下進(jìn)行破碎，加入1×Elution buffer進(jìn)行溶膠

2)將溶膠液轉(zhuǎn)入到Spin-X過濾柱中，離心力作用下回收溶膠液

3)向上述溶膠液中加入Linear Acrylamide、3M NaAc及100% Ice cold ethanol，低溫沉淀30min

4)將上述沉淀液在離心機(jī)下離心，然后用80%乙醇洗滌沉淀

5)用TE buffer溶解沉淀，即為SRNA文庫

3.9文庫質(zhì)檢

文庫通過 Qsep-400 方法進(jìn)行質(zhì)檢，滿足如下指標(biāo)即可上機(jī)檢測(cè)

3.10建庫試劑耗材

1)文庫構(gòu)建試劑盒：VAHTS Small RNA Library Prep Kit for iiiumina v2，貨號(hào)NR811-02

2)產(chǎn)物純化磁珠：VAHTSTM DNA Clean Beads，貨號(hào)N411-03

3)質(zhì)檢使用試劑：Qsep400 標(biāo)準(zhǔn)DNA 卡夾

4)定量使用試劑： Qubit TM dsDNA HS Assay Ki

5)1.5ml離心管、0.2ml PCR管、10ul，200ul槍頭：Axygen

3.11建庫設(shè)備

4、測(cè)序方法

測(cè)序設(shè)備：NovaSeq X plus

測(cè)序試劑盒：NovaSeqTM X? Series25B Rgt Kit

研究背景

在植物中miRNA是源自有發(fā)夾結(jié)構(gòu)單鏈前體的內(nèi)源性小RNA。miRNA和其靶基因的進(jìn)化代表了一種動(dòng)態(tài)的基因表達(dá)通路，它們?cè)跊Q定植物不同器官發(fā)育中起基礎(chǔ)性的作用。本文利用高通量小RNA測(cè)序的手段研究了山茶花5個(gè)器官的miRNA空間表達(dá)譜。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

材料：Camellia
取樣組織：五個(gè)組織材料（幼嫩葉片、雄蕊、花瓣、心皮和花芽），三個(gè)生物學(xué)重復(fù)
測(cè)序策略：百邁客Illumina HiSeq? 2500 ，SE36
測(cè)序數(shù)據(jù)量：每個(gè)樣本測(cè)了18.9~28.2M的數(shù)據(jù)量

設(shè)計(jì)思路

研究結(jié)果

1、山茶花5個(gè)組織保守miRNA分析和新miRNA鑒定
miRDeep2軟件鑒定175個(gè)潛在的miRNA。長(zhǎng)度分布分析顯示21和22bp的miRNA豐度*高；對(duì)成熟miRNA的堿基偏好性分析：21和22bp的miRNA首位堿基偏好于“U”；23和24bp的miRNA首位堿基偏好于“A”。

miRNA長(zhǎng)度分布

miRNA堿基偏好性

2、山茶花中MIR160家族的結(jié)構(gòu)和進(jìn)化分析
將成熟的miRNA比對(duì)到植物的ncRNA Database鑒定到19個(gè)miRNA。以MIR160家族為例進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析：基于pre-miRNA序列來構(gòu)建MIR160家族系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示保守的c38436.graph_c0_79977與來自葡萄、楊樹、木薯和蓮花的MIR160形成了一個(gè)分枝，這也與山茶花的進(jìn)化地位相一致。

miRNA 160系統(tǒng)進(jìn)化樹

3、組織間miRNA差異表達(dá)分析

組間差異表達(dá)miRNA維恩圖

4、組織特異性miRNA鑒定
對(duì)不同組織miRNA表達(dá)情況繪制聚類熱圖，大部分miRNA在不同組織中特異表達(dá)。miRNA表達(dá)聚類熱圖顯示一些明顯有著不同表達(dá)模式的亞簇，在此主要關(guān)注了雄蕊和心皮所特異的2個(gè)亞簇。對(duì)雄蕊中特異表達(dá)的miRNA靶基因進(jìn)行GO注釋，顯著富集GO term為“DNA intergration ”和“氧化還原”。

miRNA表達(dá)量聚類熱圖及GO注釋

5、miRNA-靶基因的表達(dá)相關(guān)性驗(yàn)證
選取6個(gè)miRNA及其靶基因進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)4對(duì)表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)的關(guān)系。例如miRNA167靶向2個(gè)SPL基因，用qPCR進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示出強(qiáng)的負(fù)相關(guān)關(guān)系。

miRNA及靶基因表達(dá)量相關(guān)性

6、山茶花中家系特異的miRNAs
(1).為了鑒定山茶花中家系特異miRNA家族，對(duì)不同植物中的miRNA家族構(gòu)建進(jìn)化樹。發(fā)現(xiàn)2個(gè)葡萄特異的miRNA家族出現(xiàn)在山茶花中，其中miR3633是高豐度和高識(shí)別度的，表明它出現(xiàn)在葡萄和山茶花分化之前。

miRNA家族進(jìn)化樹

(2).鑒定到12個(gè)山茶花家系特異miRNA，將其前體序列與NCBI中山茶花和葡萄轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)。在葡萄數(shù)據(jù)集里沒有發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的miRNAs，但是大部分都出現(xiàn)在其他山茶花種里，說明這12個(gè)miRNAs是以家系特異的方式進(jìn)化的。

文章亮點(diǎn)

1：材料選擇；
山茶花是觀賞植物，因其在不同類型重瓣上產(chǎn)生額外的花瓣形成它獨(dú)特的觀賞價(jià)值。了解其花器官發(fā)育的分子機(jī)制有助于新品種的培育。

2：深度數(shù)據(jù)挖掘，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；
從組織特異性和發(fā)育調(diào)控方面，鑒定了組織特異性保守miRNA，深入進(jìn)行靶基因功能注釋富集分析揭示其參與器官形成的機(jī)制；重點(diǎn)關(guān)注控制花器官發(fā)育的miRNA-靶基因調(diào)控機(jī)制，并選擇一些關(guān)鍵miRNA-靶基因進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為miRNA-靶基因環(huán)狀調(diào)控方式提供了依據(jù)。

3：新的分析角度；
從進(jìn)化角度對(duì)山茶花屬的miRNA進(jìn)行了分析，描述了山茶花屬miRNA家系特異型的進(jìn)化方式。