英文名:Long Non-coding RNA Derived from lncRNA– mRNA Co-expression Networks Modulates the Locust Phase Change

期刊：Genomics Proteomics Bioinformatics

IF：7.051（1區(qū)）

通訊作者單位：中科院、河北大學(xué)

研究背景

長鏈非編碼RNA（lncRNA）調(diào)節(jié)基因表達(dá)、動物行為等各種生物學(xué)過程。盡管蛋白質(zhì)編碼基因、microRNA和神經(jīng)肽在亞洲飛蝗的表型可塑性調(diào)節(jié)中起著重要作用，但有關(guān)lncRNA在此過程中功能研究較少。本文應(yīng)用高通量RNA-seq來比較蝗蟲型變時程中l(wèi)ncRNA和mRNA的表達(dá)模式。結(jié)果顯示lncRNA在型變的早期階段反應(yīng)更快。功能注釋表明，早期改變的lncRNA在分散和群居階段采用了不同的途徑來應(yīng)對種群密度的變化。篩選了分散和群居階段的網(wǎng)絡(luò)中兩個重疊的中樞l(wèi)ncRNA基因座進(jìn)行功能驗證。本文進(jìn)一步證明LNC1010057為潛在的蝗蟲型變因子。這項工作為深入了解蝗蟲型變的分子機制并擴大lncRNA在動物行為中的作用范圍提供了重要的數(shù)據(jù)。

材料方法

實驗材料：散居化處理為將群居型蝗蟲單獨飼養(yǎng)0h、4h、8h和16h后取出手機蝗蟲大腦進(jìn)行測序；

群居化處理為將10只散居型蝗蟲與20只群居型蝗蟲飼養(yǎng)于一個小籠子（10厘米×10厘米×10厘米）中，于0h、4h、8h和16h后取出，收集蝗蟲大腦進(jìn)行測序。在同一時間點采集樣品的三個生物學(xué)重復(fù)，提取RNA，建立cDNA文庫并進(jìn)行RNA-seq。對lncRNA和mRNA進(jìn)行差異表達(dá)分析及qRT-PCR驗證，對不同時間點的樣本進(jìn)行STEM(ShortTime-seriesExpressionMiner)分析，并構(gòu)建lncRNA–mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。對目標(biāo)中心節(jié)點lncRNA進(jìn)行RNAi，采集其行為錄像數(shù)據(jù)進(jìn)行行為數(shù)據(jù)分析。

實驗結(jié)果

1、蝗蟲lncRNA的外顯子比mRNA少但更長

研究發(fā)現(xiàn)大約78％的lncRNA包含2個外顯子，而mRNA中包含的外顯子數(shù)量為1至120（圖1C）。因此，lncRNA的外顯子明顯長于mRNA的外顯子（平均長度1142bpvs.263bp，圖1D，左）。同時，lncRNA的內(nèi)含子明顯短于mRNA的內(nèi)含子（平均長度：10086bpvs.12442bp，圖1D，右）。表達(dá)水平分析表明，lncRNA的總體表達(dá)水平明顯低于mRNA的表達(dá)水平（平均值為0.6vs.1.9；圖1E）。但是，表達(dá)特異性分析表明，lncRNA的表達(dá)受時間限制的程度要高于mRNA（平均值為0.672對0.436圖1F）?；谙鄬τ趍RNA的lncRNA基因組位置，蝗蟲lncRNA被分類為基因間、重疊區(qū)、有義內(nèi)含子、反義內(nèi)含子、有義外顯子和反義外顯子?；认x77％以上的lncRNA是長基因間的ncRNA（lincRNA，圖1G）。這些結(jié)果表明，蝗蟲lncRNA與mRNA在結(jié)構(gòu)和表達(dá)上有很大不同。蝗蟲lncRNAs更長，具有更少但更長的外顯子和更短的內(nèi)含子。此外，lncRNA的表達(dá)模式顯示出比mRNA更高的時間特異性。

圖1lncRNA和mRNA之間的不同結(jié)構(gòu)和表達(dá)

2、群居型蝗蟲中特異性表達(dá)的lncRNA比在散居型蝗蟲中表達(dá)的更多

在散居型和群居型蝗蟲大腦中共表達(dá)9722個lncRNA（73.9％），而散居型蝗蟲中特異性表達(dá)962個lncRNA（7.3％），群居型蝗蟲中特定表達(dá)2469個lncRNA（18.8％）（圖2A，頂部）。分別在散居型和群居型蝗蟲中特異性表達(dá)了479和1090個mRNA（3.1％和7.1％）（圖2A，底部）。這些結(jié)果表明，與mRNA相比，在兩個蝗蟲相型特異性表達(dá)的lncRNA的百分比更高，而在群居蝗蟲中比散居型蝗蟲中表達(dá)的lncRNAs更多。與散居型蝗蟲相比，群居型蝗蟲中335個lncRNA和779個mRNA的表達(dá)水平下調(diào)，而313個lncRNA和261個mRNA的表達(dá)上調(diào)[倍數(shù)變化（FC）>2和P<0.05；圖2B]。lincRNA在下調(diào)和上調(diào)的lncRNA中所占的比例高（分別為81.2％和87.8％），其次分別是反義外顯子和有義內(nèi)含子lncRNA（圖2B）。在表達(dá)中按FC排名的前10個lncRNA基因顯示在圖2C中。這表明散居型和群居型蝗蟲大腦中表達(dá)的lncRNA的數(shù)量及其表達(dá)水平明顯不同。

圖2lncRNA在蝗蟲型變中顯示出不同的表達(dá)變化模式

3、lncRNA對種群密度變化的快速應(yīng)答

為了進(jìn)一步分析lncRNA和mRNA的表達(dá)模式，使用了短時間序列表達(dá)挖掘器（ShortTime-seriesExpressionMiner，STEM）對基于表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行聚類。在CS期間，將214個lncRNA和242個mRNA分別分為8個和9個重要的表達(dá)譜（圖3D）。其中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜15以及mRNA表達(dá)譜15、13和16直到群居化處理后8或16小時才改變。這些配置文件稱為后期更改的配置文件（模式d）。與后期更改的配置文件相反，早期更改的配置文件以4小時時間點開始的轉(zhuǎn)錄表達(dá)變化為特征。根據(jù)4小時后的表達(dá)變化，將早期變化的輪廓細(xì)分為模式a（早期變化）、模式b（早期中變化）和模式c（可持續(xù)變化）。在IG過程中，269個lncRNA和639個mRNA分別聚集成6個和7個顯著表達(dá)譜。所有l(wèi)ncRNA配置文件均為早期變化（圖3E）。在mRNA表達(dá)譜中，有6個是早期改變的，而譜12是晚期改變的。在CS和IG期間，lncRNA的聚類分布圖的數(shù)量與mRNA的分布無明顯差異。但是，通過計算譜圖中的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量，發(fā)現(xiàn)早期改變的lncRNA的百分比比CS中的mRNA的百分比高61.1％（88.3％vs.54.8％，圖3F）。同樣，IG中早期改變的lncRNA的百分比高于IG中的mRNA（100％vs.81.3％，圖3F）。因此，lncRNA比mRNA對散居化和群居化處理的反應(yīng)更快。在CS中，早期改變的lncRNA的表達(dá)變化速率快于285個mRNA的表達(dá)變化速率（0.55vs.0.24）和IG（0.77vs.0.39）（圖3G）。因此，早期改變的lncRNA的比例和表達(dá)變化率高于早期改變的mRNA。因此，蝗蟲lncRNA比mRNA對種群密度的變化更敏感。

圖3lncRNA對散居化和群居化處理的快速反應(yīng)

4、lncRNA參與CS和IG早期變化的不同途徑

在CS中，自噬調(diào)節(jié)、剪接體和肌醇磷酸代謝途徑在上位和至少兩個模塊中均過代表（圖4C）。因此，CS中早期改變的lncRNA可能在調(diào)節(jié)自噬、RNA剪接和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用。lncRNA對自噬的調(diào)控參與了群居化的初期和中期，而對剪接體和磷酸肌醇代謝的調(diào)控則參與了整個過程。與神經(jīng)遞質(zhì)釋放有關(guān)的突觸小泡循環(huán)途徑的lncRNA僅在模式a（早期改變）模塊中被過代表（圖4C）。該結(jié)果表明，早期改變的lncRNA可能在CS期間調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)中具有重要作用。此外，一些lncRNA與已知的型變相關(guān)基因密切相關(guān)。例如，早期改變的lncRNALNC531328.2、LNC1425451.2、LNC1088763.7和LNC492755.1與基因NPYR、NPF1a和Vat1相關(guān)（圖4A）。持續(xù)變化的lncRNALNC494161.1和LNC1065048.14與多巴胺途徑中的基因Ebony和Vat1相關(guān)。在CS網(wǎng)絡(luò)中，程度值前5％的lncRNA被視為hublncRNA（圖4A）。計算了lncRNA基因座的程度值，在CS中，基于度數(shù)排名前5％的10個lncRNA基因座被鑒定為hublncRNA。其中，四個基因表達(dá)上調(diào)，其他六個基因表達(dá)下調(diào)（圖4D）。在IG期間，包括谷氨酸能突觸、多巴胺能突觸和膽堿能突觸途徑在內(nèi)的與突觸有關(guān)的途徑得以豐富。這些途徑中的大多數(shù)都富含早期改變的模塊。同時，多巴胺能突觸和膽堿能突觸途徑僅參與模式a（早期改變）的模塊（圖4E）。IG中也豐富了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，例如鈣信號傳導(dǎo)、Ras信號傳導(dǎo)、胰島素信號傳導(dǎo)和MAPK信號傳導(dǎo)途徑。功能注釋的結(jié)果表明，與CS相比，IG中早期變化的lncRNA參與的突觸相關(guān)和信號處理途徑更多。

圖4早期改變的lncRNA參與CS和IG的不同途徑

5、LNC1010057可能調(diào)節(jié)蝗蟲型變

為為了驗證LNC1010057和LNC992414在蝗蟲型變中的功能，進(jìn)行了一系列分子生物學(xué)實驗。首先，克隆了在LNC1010057和LNC992414基因座中鑒定出的長的轉(zhuǎn)錄本。LNC1010057由重復(fù)的A、B和C元素組成，這些元素依次分布并重復(fù)4次，但C元素重復(fù)三次（圖5A）。序列比對證明LNC992414在5’端與LNC1010057共享相似的重復(fù)序列，但是它們是從不同的基因組基因座轉(zhuǎn)錄而來的（圖5A）。盡管LNC992414的定量表達(dá)水平可以通過特異性引物檢測，但LNC1010057的表達(dá)水平為重復(fù)元件的總表達(dá)水平。如預(yù)期的那樣，LNC1010057和LNC992414的表達(dá)模式極為相似。在CS期間，兩種lncRNA的表達(dá)持續(xù)增加，并且在16h幾乎增加了四倍（圖5B）。在IG期間，4h后表達(dá)水平顯著下降，之后保持相對穩(wěn)定（圖5B）。LNC1010057和LNC992414之間的序列結(jié)構(gòu)和表達(dá)模式的相似性表明它們是同源的lncRNA。但是，實時qPCR分析表明，在散居型和群居型蝗蟲的大腦中，LNC1010057的表達(dá)水平比LNC992414的表達(dá)水平高約1000倍（圖5C）。其次，為了測試LNC1010057和LNC992414是否參與蝗蟲型變調(diào)節(jié)，在通過RNAi抑制蝗蟲大腦中的表達(dá)后進(jìn)行了行為分析。顯著降低LNC1010057的表達(dá)水平（7470對3764610）和LNC992414（1.9vs.1.0）（圖5D）后行為分析表明，群居型蝗蟲其行為顯著改變?yōu)樯⒕訝顟B(tài)（圖5E）。此外，多個與型有關(guān)的行為參數(shù)發(fā)生了變化?？傄苿泳嚯x（TDM）和總移動持續(xù)時間（TDMV）顯著降低（圖5F），但是，移動速度沒有區(qū)別。同時群居蝗蟲的特定喜好行為顯著下降（58.3對-13.5圖5F）。但LNC992414表達(dá)降低并未引起從群居狀態(tài)到散居狀態(tài)的轉(zhuǎn)變（圖5G和H）。與對照相比，與型相關(guān)的行為參數(shù)（包括運動和特定物種的優(yōu)選行為）沒有差異（圖5I）。LNC992414的RNAi實驗不會引起行為變化，因此排除了LNC992414調(diào)節(jié)蝗蟲型變的可能性。這些結(jié)果表明是LNC1010057而不是LNC992414潛在地調(diào)節(jié)了蝗蟲的型變。

圖5LNC1010057潛在地調(diào)節(jié)了蝗蟲的型變

總結(jié)

lncRNA被證實是生物過程的關(guān)鍵調(diào)控因子，調(diào)節(jié)包括mRNA轉(zhuǎn)錄、穩(wěn)定性、翻譯和翻譯后修飾等多種生物途徑。之前研究表明昆蟲lncRNA參與了例如殺蟲劑抗性、繁殖力和腺體凋亡等生物過程，但是尚未有證據(jù)證明lncRNA可以調(diào)節(jié)非模型昆蟲的行為。蝗蟲是世界范圍內(nèi)的一種農(nóng)業(yè)害蟲，表現(xiàn)出顯著的表型可塑性。為了鑒定與其型變相關(guān)的lncRNA，本文系統(tǒng)地分析了蝗蟲lncRNA的表達(dá)并注釋其功能，證實與mRNAs相比lncRNAs顯示對型變更敏感的響應(yīng)，并證實了其中一個lncRNA可調(diào)節(jié)型變相關(guān)行為。本研究揭示了lncRNA在蝗蟲型變中的重要作用以及表型中蛋白編碼基因和lncRNA之間的相互作用。深入解析蝗蟲散居型和群居型轉(zhuǎn)變的分子機制，為可持續(xù)治理蝗蟲的新策略和新方法的開發(fā)提供了基礎(chǔ)。

研究背景

細(xì)胞自噬是一種非常保守的細(xì)胞內(nèi)降解系統(tǒng)，近期的研究表明小鼠中細(xì)胞自噬現(xiàn)象表現(xiàn)出了生物鐘節(jié)律，nr1d1基因缺陷能導(dǎo)致小鼠骨骼肌中自噬活動的紊亂。然而生物鐘調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的機理還不清楚。斑馬魚的細(xì)胞自噬活動是否表現(xiàn)出生物鐘節(jié)律還沒有報道，本研究旨在以斑馬魚為實驗材料研究nr1d1基因在調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的生物鐘節(jié)律方面的作用。

實驗設(shè)計

實驗材料：2種材料：野生型WT和nr1d1突變型斑馬魚
2個時間點：CT2和CT14（分別為受精后122和134小時）;
無生物學(xué)重復(fù)
測序方法：百邁客Illumina HiSeq2000 PE125

結(jié)果展示

1.表型描述及關(guān)鍵基因在幼魚和肝臟中的表達(dá)情況

首先用TEM（透射電鏡）對一天內(nèi)不同時間（ZT0，ZT6，ZT12，ZT18）的肝臟切片進(jìn)行觀察，統(tǒng)計一天內(nèi)自噬體數(shù)量的變化（紅色箭頭處，圖1，A），并進(jìn)行統(tǒng)計（圖1，B），研究表明斑馬魚肝臟內(nèi)自噬體的數(shù)量符合生物鐘節(jié)律。

TEM觀測及自噬體數(shù)量統(tǒng)計結(jié)果

選取了幾個以前研究過的與自噬體形成、移動、延伸、融合、降解有關(guān)的基因進(jìn)行RT-PCR分析，如maplc3b，bnip3，becn1等。材料為受精后72-96小時的斑馬魚幼體和肝臟材料。由圖可見這些基因都表現(xiàn)出明顯的生物鐘節(jié)律。圖中白色底色表示白天，灰色底色表示黑夜。

圖2 關(guān)鍵基因的RT-PCR檢測

2.用TALEN技術(shù)構(gòu)建nrid1突變斑馬魚，并進(jìn)行表型研究和關(guān)鍵基因表達(dá)分析

用TEM觀察WT和nr1d1突變斑馬魚肝臟中的自噬體數(shù)量，研究表明自噬體數(shù)量在nr1d1中明顯高于WT。

圖3 不同樣品斑馬魚肝臟自噬體觀測及統(tǒng)計

用RT-PCR研究在WT和nr1d1突變斑馬魚中關(guān)鍵基因的表達(dá)差異，nr1d1突變體中基因表達(dá)模式與WT中明顯不同。

圖4 差異基因的RT-PCR驗證

3.用ChIP和熒光素酶研究Nr1d1直接調(diào)控的下游基因

體外熒光素酶實驗表明Nr1d1蛋白能直接結(jié)合ulk1a基因的promoter區(qū)域，體內(nèi)ChIP實驗進(jìn)一步證明Nr1d1蛋白能夠結(jié)合ulk1a基因的promoter區(qū)域。說明Nr1d1能直接調(diào)控ulk1a基因的表達(dá)。

圖5 熒光素和chip結(jié)果

4. 野生型WT和nr1d1突變型斑馬魚轉(zhuǎn)錄組分析

為了進(jìn)一步說明nr1d1基因的功能，文章選取了野生型WT和nr1d1突變型斑馬魚進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組研究，并且取了2個時間點（CT2和CT14）。研究表明在CT2階段兩者有975個差異表達(dá)基因，在CT14階段有1360個差異表達(dá)基因。與WT相比，在nr1d1突變體中上調(diào)的基因數(shù)量要大于下調(diào)的基因數(shù)量。

同時，選取部分關(guān)鍵的差異表達(dá)基因進(jìn)行RT-PCR驗證，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致。

圖6 差異基因韋恩圖

圖7 差異基因聚類圖

圖8 關(guān)鍵基因的RT-PCR驗證

研究結(jié)論

通過研究WT野生型和nr1d1突變型斑馬魚的基因表達(dá)情況，表明Nr1d1基因在生物鐘調(diào)節(jié)和細(xì)胞自噬過程中起著重要作用。生物鐘相關(guān)基因直接受Nr1d1調(diào)控。此外，通過轉(zhuǎn)錄組分析表明Nr1d1還調(diào)控脅迫、代謝、信號傳導(dǎo)、翻譯后修飾等生理過程。

圖9 Nr1d1在生物鐘和細(xì)胞自噬過程中的作用模式圖

亮點

1.首次利用斑馬魚研究生物鐘和細(xì)胞自噬的關(guān)系；
2.發(fā)現(xiàn)Nr1d1在生物鐘調(diào)節(jié)和細(xì)胞自噬過程中的關(guān)鍵作用；
3.轉(zhuǎn)錄組研究進(jìn)一步證明Nr1d1的作用，并揭示Nr1d1其它生理功能。
4.雖然轉(zhuǎn)錄組的內(nèi)容在這篇文章中比重不大，但卻揭示了除了生物鐘調(diào)節(jié)和細(xì)胞自噬，Nr1d1基因還有很多其它的功能，顯著提升了文章的水平，并為后續(xù)研究打好了基礎(chǔ)。

研究背景

小球藻為單細(xì)胞可食用綠藻，能夠合成蝦青素和油脂；蝦青素是一種結(jié)構(gòu)獨特的酮式類胡蘿卜素，是自然界已知最強的抗氧化劑。含油脂高的藻類可作為生物質(zhì)能源。

實驗設(shè)計

材料選擇：小球藻 取種子細(xì)胞培養(yǎng)到生長對數(shù)期的后期，分成3組，用于做不同處理；
處理方式：對照組T1：不做處理；
高光處理組T2：光照90μmol光子?2 s?1，6h；
葡萄糖誘導(dǎo)組T3：30g/L葡萄糖處理， 6h；
測序方法：Hiseq2500，4G/樣；

技術(shù)路線：

研究結(jié)果

1. 蝦青素和脂類定量分析

對照和葡萄糖處理組相比，葡萄糖誘導(dǎo)下的小球藻中，蝦青素含量96h后增加了30倍，而處理組中96h后只增加了8倍。脂類和TFA含量也有類似的情況。對照組中這三種成分增加較少可能是培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分限制的原因，在氮饑餓的情況下，導(dǎo)致在相同器官中蝦青素和脂肪酸產(chǎn)量增加。

2. RNA-SEQ分析

三種不同的處理構(gòu)建三個文庫，測序獲得clean data 10.63G，Trinty組裝獲得32931個unigenes。52.8%的unigenes在NR,Swiss-Prot,KEGG,GO,COG獲得注釋。

3. 差異表達(dá)基因分析

計算RPKM，做差異表達(dá)分析。T1與T2差異表達(dá)基因數(shù)為580，T1與T2差異表達(dá)基因數(shù)為1489。在光處理和葡萄糖處理兩種情況下，差異基因功能注釋表明這些基因都是與翻譯、核糖體、蛋白過程、脅迫和碳固定相關(guān)的。在光處理下，卟啉和葉綠素代謝、光刺激應(yīng)答是被富集的。在葡萄糖處理情況想，葡萄糖、能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化、脂肪合成等都是被富集的；而這些基因在光合作用、核糖體、蛋白運輸通路中是減少的。在碳源充足的情況下，生長和能量存儲基因是上調(diào)表達(dá)的，而光合作用是下調(diào)表達(dá)的。

4. RT-PCR驗證

作者選了10個與蝦青素和三酰甘油合成有關(guān)的unigenes進(jìn)行了RT-PCR驗證，其中9個基因的表達(dá)趨勢與RNA-seq結(jié)果一致。只有PDS兩種結(jié)果不同，可能是RNA-seq結(jié)果不準(zhǔn)確，因為前人的研究成果中，葡萄糖是上調(diào)PDS表達(dá)的，與本文中RT-PCR結(jié)果一致。

5. 蝦青素合成

在轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)MEP通路中的8個基因都被鑒定到，但是在MVA通路中只有2個基因被檢測到，其中HMG表達(dá)不顯著，ACAT表達(dá)量下降。這些結(jié)果表明小球藻中蝦青素的合成通路中IPP和DMAPP是MEP通路合成的。其中，發(fā)現(xiàn)一個可能編碼β-胡蘿卜素激酶（BKT2）與數(shù)據(jù)庫中的BKT1比對率僅為56%。功能分析發(fā)現(xiàn)BKT2可以轉(zhuǎn)化β-胡蘿卜素成為角黃素。下圖為蝦青素合成通路圖。在葡萄糖處理情況下，與蝦青素合成相關(guān)的6個基因上調(diào)差異表達(dá)。在小球藻中，葡萄糖誘導(dǎo)蝦青素的合成，伴隨著BKT1，CHYb,PDS在24h內(nèi)上調(diào)表達(dá)。為研究轉(zhuǎn)錄組水平基因表達(dá)量與產(chǎn)物含量的關(guān)系，分析了5個限速基因的表達(dá)量，這些基因在葡萄糖處理72h或92h表達(dá)量達(dá)到最高，相應(yīng)的，蝦青素的積累量也在96h達(dá)到穩(wěn)定水平。

6. 三酰甘油的合成

藻類和植物中脂肪酸的生物合成主要在葉綠體中進(jìn)行。乙酰-CoA作為合成的起始物質(zhì)?；谵D(zhuǎn)錄組測序，小球藻質(zhì)體中脂肪酸合成基因被鑒定到。在葡萄糖處理情況下，這些基因大都表達(dá)量上調(diào)。另外這次測序結(jié)果中還發(fā)現(xiàn)幾個基因?qū)?yīng)的不同轉(zhuǎn)錄本。由于BC和SAD是脂肪酸合成的限速酶基因，做了進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)BC和SAD表達(dá)量從6h到72h表達(dá)量持續(xù)上升，對應(yīng)的三酰甘油含量從24h到96h持續(xù)增加。

三酰甘油（TAG）合成有兩條通路：乙酰-CoA依賴的通路和乙酰-CoA不依賴的通路；轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中兩條通路中的基因都被鑒定到。

文章亮點

1：材料選擇+處理條件；
小球藻關(guān)注的成分具有重要的經(jīng)濟價值，處理條件是可以促進(jìn)經(jīng)濟成分積累，研究更加有利用價值；

2：實驗數(shù)據(jù)+前人結(jié)果，深入驗證；
測序結(jié)果中重點關(guān)注關(guān)鍵成分（蝦青素和TAG）合成通路中的每一個基因，對其進(jìn)行差異分析，并做不同時期的表達(dá)量分析；解釋清楚在處理情況下，物質(zhì)合成與基因表達(dá)的關(guān)系。針對本文的研究結(jié)果與前人研究成果比較分析。

在瘤胃中的短鏈脂肪酸（SCFAs）對反芻動物的生長和健康起著關(guān)鍵的作用，微生物G蛋白偶聯(lián)受體（GPR）和微生物脫乙?；福℉DAC）可能是這些影響的主要調(diào)節(jié)通路。該研究主要是選用不同比例非纖維碳水化合物攝入（15-30%）的山羊模型，通過轉(zhuǎn)錄組測序和16srRNA測序聯(lián)合研究瘤胃上皮細(xì)胞和瘤胃微生物協(xié)同的響應(yīng)機制。通過研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃中微生物來源的SCFAs對上皮細(xì)胞的生長和代謝受到GPR和HDAC調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的影響，通過對這些調(diào)控機制和飲食組成的相互關(guān)系的理解，可更深入的了解瘤胃的新陳代謝機制，更好的促進(jìn)牧業(yè)的發(fā)展。

樣品取材：共6只雄性山羊，隨機分為兩組，第一組飼養(yǎng)為65%的干草+35%的飼料（MC組），另一組為90%的干草+10%的飼料（LC組）；喂養(yǎng)28d后進(jìn)行取樣。

微生物多樣性樣品：飼養(yǎng)第28天，在清晨喂養(yǎng)0h、2h、5h以及8h進(jìn)行取樣，瘤胃內(nèi)容物用4層紗布取樣 ，收集瘤胃液15ml，-20℃保存用于提取。

轉(zhuǎn)錄調(diào)控測序取樣：取10cm2瘤胃組織，用冷卻的PBS進(jìn)行清洗，去除肌肉層，取上皮組織切塊于TRIzol保存液保存。液氮速凍5min后，-80保存用于RNA提取。

短鏈脂肪酸（SCFAs）濃度測定：上述樣品加入5%HgCl2用于濃度測定。

測序分析：

瘤胃內(nèi)容物微生物多樣性測序：細(xì)菌V3+V4區(qū)、Illumina Miseq 平臺測序

瘤胃上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序測序： PE125 測序、Illumina Hiseq2500 平臺測序

飼養(yǎng)不同處理組（MC和LC）、喂養(yǎng)取樣不同時間點間瘤胃內(nèi)總短鏈脂肪酸（SCFA）、PH以及短鏈脂肪酸（SCFA）主要成分的變化情況進(jìn)行分析，如下圖。

?圖1.1?總SCFA變化情況

圖1.2?PH變化情況

圖1.3?SCFA主成分變化情況

2、瘤胃微生物多樣性分析：

2.1細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

在細(xì)菌門水平，一共有14個原核的門被鑒定，主要是厚壁菌門（35.7-30.1%），擬桿菌門（26.6-43.6%）、互養(yǎng)菌門（11-7%），且通過門水平維恩圖分析發(fā)現(xiàn)，在兩組（MC和LC）間門水平組成相同，比較分析兩組間微生物變化情況發(fā)現(xiàn)（如圖：FIG2），MC組相比于LC組，互養(yǎng)菌門增長了57%，無壁菌門增長了330%。而黏膠球形菌門降低了63%，纖維桿菌門降低了65%；

圖2.1?兩組間門水平Venn圖分析

圖2.2 兩組間門水平OTU分析

在細(xì)菌屬水平。共鑒定出75個屬水平細(xì)菌，在兩組間共有70個屬，在MC組有三個特有的屬，在LC水平有2個特有的屬，普氏菌屬（10.4-17.9%）在兩組間都為主要屬水平的菌。

圖3.1 兩組間屬水平Venn圖分析

圖3.2?兩組間屬水平OTU分析

2.2 微生物群落的多樣性和豐富性

在門水平，MC組的擬桿菌門和厚壁菌門顯著性高于Lc組（P＜0.05），互養(yǎng)菌門顯著性低于Lc組（如下圖4），通過最大似然法（ML）計算27個豐度大于1% 的OTU進(jìn)行分析顯示，在MC組顯著增加的OTU屬于子單胞菌科，疣微菌科、韋榮球菌科、疣微菌門，相反的，58%（7/12）顯著降低的OTU屬于普雷沃氏菌科（如下圖5）；

?圖4

圖5

3.瘤胃表達(dá)譜分析：

3.1 瘤胃上皮細(xì)胞GPRs和HDACs的表達(dá)譜分析

RNA-Seq測序方法用于研究山羊瘤胃微生物G蛋白偶聯(lián)受體（GPRs）和微生物脫乙酰化酶（HDACs）表達(dá)情況以及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，過濾得到127M clean data，平均有83%數(shù)據(jù)比對到NCBI山羊參考基因組，得到73個GPR家族成員和11個HDAC家族成員比對到山羊基因組，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)有20個GPR家族成員和7個HDAC家族成員在瘤胃上皮細(xì)胞中表達(dá)。通過比較LC組中基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)GPR1，87，89A，155顯著上調(diào)（P＜0.05），在MC組中GPR107，游離脂肪酸受體4（FFAR4, also known as GPR120），羥基烴酸受體2（HCAR2, also known as GPR109A）顯著上調(diào)（P＜0.05），通過組內(nèi)基因表達(dá)分析，在兩組內(nèi)都發(fā)現(xiàn)GPR家族中GPR87表達(dá)*高，HDAC家族中HDCA1的表達(dá)*高

3.2 GPRs和HDACs保守序列分析

為了研究GPR和HDAC在進(jìn)化過程中差異表達(dá)的保守序列，通過用所有基因進(jìn)行ML進(jìn)化樹分析，所有的 GPRS和HDACS在脊椎動物門都是高度保守的。研究GPR家族內(nèi)成員的保守序列發(fā)現(xiàn)，在GPR家族成員沒有超過30%的相似性，在HDAC家族成員之間也發(fā)現(xiàn)了同樣的結(jié)果。

圖6

3.3 差異表達(dá)的GPRS和HDACs基因相關(guān)KEGG通路分析

為了研究GPR和HDAC共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的生物學(xué)意義，改研究注釋了相關(guān)的信號通路和KEGG功能，發(fā)現(xiàn)顯著差異的鄰近基因被分類到瘤胃上皮細(xì)胞的生理調(diào)節(jié)過程，因此發(fā)現(xiàn)了兩類和上皮細(xì)胞生長調(diào)節(jié)有關(guān)系的功能網(wǎng)絡(luò)，其中一類是上皮細(xì)胞生長網(wǎng)絡(luò)（包括細(xì)胞凋亡，增殖和分化，見下圖7），另外一類是上皮細(xì)胞的代謝網(wǎng)絡(luò)（包括輔酶因子和維生素代謝，能量代謝、氨基酸代謝等，見下圖8）；

圖7：上皮細(xì)胞生長網(wǎng)絡(luò)圖

圖8：上皮細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)圖

在上皮細(xì)胞生長網(wǎng)絡(luò)中，基因GPR1，89和155的表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致LAMTOR3蛋白，蛋白激酶和ELK1表達(dá)上調(diào)，這三種蛋白都存在于MAPK信號通路上，和細(xì)胞的增殖分化有關(guān)。此外，GPR1的 表達(dá)增加和酸性酰胺酶（ASAH1）的下調(diào)相關(guān)，ASAH1存在于調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、生存和增殖的信號通路上。對于HDACs家族基因HDAC4,5,6和10基因的上調(diào)和五個調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，生存和增殖基因的下調(diào)有關(guān)。

在上皮細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)中，GPR1、87和89A基因的上調(diào)表達(dá)與輔酶2、4以及4L（ND2，4，4L），ATP5H，NDUFA4有關(guān)，HDAC1的下調(diào)表達(dá)ND6的上調(diào)表達(dá)有關(guān)。以上所有相關(guān)的酶都和能量代謝的氧化磷酸化有關(guān)。

4.轉(zhuǎn)錄調(diào)控和16s rRNA數(shù)據(jù)聯(lián)合分析?

GPR和HDAC的表達(dá)、SCFAS主成分濃度比例以及屬水平細(xì)菌相對豐度關(guān)系分析

通過CCA相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，顯著上調(diào)的GPRs和HDACs與8個顯著增加的微生物屬（56個 OTUS）是呈正相關(guān)，顯著下調(diào)的GPRs和HDACs和9個顯著減少的細(xì)菌屬呈正相關(guān)（63個OTU），然而HDAC1與丁酸鹽的比例呈負(fù)相關(guān)。

該研究得到的結(jié)果揭示，SCFA調(diào)節(jié)的GPR和HDAC共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)存在于瘤胃的上皮細(xì)胞，該共調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)作用可作用于動物敏感√確地接受微生物區(qū)的信號調(diào)節(jié)，這些調(diào)控網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞各種生理學(xué)過程，尤其是細(xì)胞的生長和新陳代謝，在促進(jìn)動物的生長和維持上皮細(xì)胞的完整性起到關(guān)鍵的作用。此外，這些調(diào)控網(wǎng)絡(luò)重要的調(diào)控機制對于共生的細(xì)菌來說，主要通過調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞生理過程提高細(xì)菌在宿主中的共生條件。通過了解宿主動物和微生物區(qū)之間互相的調(diào)節(jié)機制，加上相應(yīng)飲食中的外界干預(yù)調(diào)節(jié)因素，可以可持續(xù)性的更好的提高動物的健康和生長。