百邁客生物為該研究提供了轉錄組測序服務。

研究背景

大豆是全球重要的植物蛋白來源，但其單產(chǎn)遠低于水稻、小麥等主糧作物。上世紀“綠色革命”通過推廣半矮稈品種大幅提升了谷物產(chǎn)量，卻也導致了對氮肥的嚴重依賴，帶來環(huán)境問題。與谷類作物不同，大豆作為豆科植物，具備與根瘤菌共生固氮的獨特能力，可從大氣中獲取70%以上的氮需求。這意味著，大豆的“綠色革命”無法簡單復制谷物路徑——我們需要在不過度施肥的前提下，同時解決三個問題：如何改良株型以提高產(chǎn)量？如何增強根瘤固氮能力？如何提升水溶性蛋白含量這一關鍵品質指標？

長期以來，能夠同時調控這些性狀的關鍵基因始終未被充分挖掘，制約了高產(chǎn)品種的選育進程。尋找既能優(yōu)化株型、又能促進固氮的“黃金基因”，正是推動大豆實現(xiàn)可持續(xù)綠色革命的核心突破口。

研究結果

? 敲除GmGID1-2改良大豆株型并提高產(chǎn)量和種子含油量

該研究團隊發(fā)現(xiàn)過表達GmGID1-2會顯著增加大豆的株高，而敲除則使株高降低，同時增加莖稈直徑和強度、分枝數(shù)、主莖節(jié)數(shù)、單株莢數(shù)?(三粒莢和四粒莢顯著增多)?和種子數(shù)，從而提高單株種子重量與大豆產(chǎn)量，并提升種子含油量。進一步結合表型數(shù)據(jù)及轉錄組數(shù)據(jù)表明，GmGID1-2與DELLA蛋白互作調控大豆株高，并通過影響與分枝、固碳作用和脂肪酸代謝等相關的通路及基因表達，進而調控大豆分枝數(shù)和種子含油量。

圖1 敲除GmGID1-2改良大豆株型并提高產(chǎn)量和種子含油量

? 敲除GmGID1-2增強大豆根瘤固氮

基于敲除GmGID1-2后大豆莢和種子數(shù)顯著增加并引起DELLA蛋白積累，以及DELLA在其他豆科植物中可促進根瘤菌侵染與根瘤共生的作用，推測在GmGID1-2敲除突變體中，為大豆提供主要氮源的根瘤固氮作用也相應增強。實驗證實，突變體中的根瘤數(shù)目和干重、固氮酶活性以及植株氮含量均顯著提高。進一步分析表明，敲除GmGID1-2促進了根瘤菌侵染、根瘤共生和固氮相關基因的表達。

圖2 敲除GmGID1-2增強大豆根瘤固氮

? 大豆GmGID1-2的優(yōu)異等位變異和一因多效功能

分析GmGID1-2的自然變異發(fā)現(xiàn)，在課題組264份大豆資源及大豆公共數(shù)據(jù)庫中，其編碼區(qū)均未鑒定到導致基因功能喪失或氨基酸變化的序列變異；而啟動子區(qū)局部關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，Gm_36396036位點與大豆株高顯著關聯(lián)。該位點將GmGID1-2啟動子分為Pro-C和Pro-T兩種類型，其中，Pro-C型啟動子的大豆株高更矮、產(chǎn)量和種子含油量更高，且GmGID1-2基因表達量更低，與GmGID1-2敲除株系表型一致。在Pro-C優(yōu)異單倍型的遺傳背景下敲除GmGID1-2，可進一步提高大豆的產(chǎn)量、種子含油量和根瘤固氮。

大豆GmGID1-2的優(yōu)異等位變異和一因多效功能

研究總結

該研究系統(tǒng)解析了GmGID1-2的一因多效性，挖掘到可同時改良大豆株型、產(chǎn)量和根瘤固氮的優(yōu)異等位變異，并創(chuàng)制了更優(yōu)異的新等位基因。GmGID1-2的優(yōu)異等位基因不僅能改良大豆株型和產(chǎn)量，還可顯著增強莖桿強度、根瘤固氮能力和種子含油量，為可持續(xù)性農(nóng)業(yè)發(fā)展提供寶貴的基因資源和理論依據(jù)。

以上內容來源于南京農(nóng)業(yè)大學，侵刪

研究背景

大豆（Glycine max）是從6000到9000年前的東亞野生親緣大豆中馴化而來，導致了巨大的形態(tài)和生理變化，統(tǒng)稱為“馴養(yǎng)綜合癥”。一些與馴化有關的性狀（DRT）受一主要QTL控制，并且不同DRT所基于的某些QTL區(qū)域重疊。

許多豆科植物的種皮上都有一層含有致敏性過敏原的泥膜，使得種子不易被看見，為潛在的掠食者提供了雙重保護，保護后代。然而，無泥膜的光澤的種子對于人類消費和健康是有利的，并且是馴化選擇的目標。較早的研究提出，三個互補基因B1，B2和B3控制花開發(fā)育，但多項研究僅檢測到13號染色體上的B1基因座。

技術路線

結果展示

圖1.?G. max、?G. soja及其子代的種皮光澤

為了確定從開花到無花表型馴化過渡的基礎關鍵基因，將無花大豆品種Williams 82引入兩個高度不同的開花G. soja品種PI468916和PI 479752，并獲得了由大約3500個RIL組成的兩個F_6：7重組自交系（RIL）群體。以Williams 82作為母本的雜交種子（F₁種子）沒有種皮開花，而衍生自F₁植物的F_1：2種子則具有種皮開花。而來自以Williams 82作為父本的雜交的F₁和F_1：2種子均攜帶種皮開花（圖1b）。兩個RIL群體的兩個子集的表型分析顯示開花與無花表型的比例為1：1。根據(jù)種皮開花與母果莢果內果皮觀察表明，兩種種皮開花主要由單個基因控制，并且在表皮上，開花表型為顯性或部分顯性。值得注意的是，開花RIL之間的種皮開花數(shù)量不同，這可能反映了少量QTL調節(jié)種皮開花積累的影響。

圖2.?B1基因克隆

隨后對RIL的兩個子集進行處理，以通過測序（GBS）進行基因分型。基因型和表型數(shù)據(jù)的組合在PI 468916和PI 479752中在13號染色體上種皮開花的基礎上定義了一個區(qū)域（圖2a），該區(qū)域與先前映射的B1區(qū)域重疊，表明這兩個種質由B1基因座控制。在映射區(qū)域內的其他標記用于鑒定兩個RIL群體中與B1基因座之間的重組體，最后根據(jù)大豆參考基因組序列將B1基因座精細映射到一個包含兩個基因（Glyma.13G241700、Glyma.13G241800）的14.5 kb區(qū)域（圖2b）。對三個親本系的兩個基因進行測序，Williams 82和兩個大豆親本之間的差異只有一個SNP位點，即Glyma13G241700的編碼序列（CDS）中的一個（C到T）點突變，導致氨基酸從半胱氨酸變?yōu)榫彼幔▓D2c）。花后5周，Glyma.13G241700在發(fā)育中的豆莢中最高表達，其在PI 468916和（Williams 82×PI 468916）F1中的表達水平相似，但均明顯高于Williams 82（圖2d）。相比之下，兩個親本中的Glyma.13G241800和F1的表達水平?jīng)]有顯著差異（圖2e）。這些觀察結果表明，雙親中的Glyma.13G241700最有可能成為B1的候選基因，預計B1編碼跨膜轉運蛋白樣蛋白（圖2f）。

然后將來自PI 4768916的Glyma.13G241700的CDS與花椰菜花葉病毒35S啟動子融合，并將融合構建體（p35S：CDS-B1）引入Williams82。兩個獨立轉化事件各自獲得約20個T1轉基因種子。如圖2g所示，在所有轉基因種子的表面均觀察到種皮開花，但在非轉基因對照中卻沒有，證明Glyma.13G241700是B1基因座。在R5（種子發(fā)育）階段，由35S啟動子驅動的轉基因B1在發(fā)育中的豆莢，豆莢果皮，種皮和種子中的表達水平顯著高于Williams 82中的b1（圖2h），并且在四個組織中的每一個中，轉基因B1的表達水平與T_1：2種子的表皮表面積累的泥膜量呈正相關。

檢查先前重新測序的62個G. soja種質和240個G. max種質是否存在種皮開花和B1位點的序列變異。發(fā)現(xiàn)2大豆和Williams 82之間B1的CDS內（C到T）多態(tài)性與302個種之間種皮開花的表型差異完全相關（圖2i），提示（C到T）點突變是表型轉變的原因。預計該點突變會導致該基因編碼的蛋白質的螺旋結構丟失，而兩個大豆親本之間的另一個SNP（A到G）并未導致該蛋白質的任何明顯結構變化（圖2j）。

隨后，將來自PI 468916的B1的CDS和來自Williams 82的b1分別與B1啟動子區(qū)域融合，并將融合的pB1：CDS-B1和pB1：CDS-b1構建體引入擬南芥以獲得T2轉基因品系。由于擬南芥的種子較小且種子表面粗糙，因此無法清楚地區(qū)分轉基因種子與非轉基因對照之間的種子表面紋理。然而，pB1：CDS-B1轉基因種子的表面比pB1：CDS-b1轉基因種子和非轉基因對照的表面更蒼白和暗沉（圖2k）。與G. soja和G. max中的B1 / b1等位基因相似（圖2d），pB1：CDS-B1在擬南芥背景中的表達水平明顯高于pB1：CDS-b1（圖2l）。 B1 / b1之間的C到T多態(tài)性與基因的表達水平有關。

圖3.?B1基因座對種子油含量的多效性影響

先前通過全基因組關聯(lián)研究（GWAS）使用302個重測序種質的子集，確定了潛在的主要QTL種子油含量，包括46 個G. soja種質和127個 G. max種質的種子油含量信息（www.ars-grin.gov/npgs）和一個246 kb 的QTL區(qū)域在35,194,140 bp處達到峰值，位于B1基因座的下游約31 kb處（圖3a）與籽油含量的變化顯著相關。由于G. soja和G. max的種子油含量差異很大，前者的平均值約為10.9％，后者的平均值約為18.0％，因此認為該油脂QTL為可能是造成栽培大豆種子油含量升高的原因。

由于B1位點和油脂QTL均被定義為一個約410 kb的“馴化”區(qū)域（由大豆馴化形成）（圖3a），想知道這兩個基因座（如果不同）是否通過連鎖同時選擇，或單個基因座是否對這兩個性狀具有多效作用，從美國農(nóng)業(yè)部大豆種質資源庫（www.ars.grin.gov/npgs）中選擇全部70個開花的G.max品種和從先前選擇用于調查GWAS種子油含量的遺傳多樣性的這個收集物中的52個“無花”的G.max品種。利用來自這122個種質的全基因組SNP數(shù)據(jù)，檢測到與B1選擇性清除區(qū)域中種皮開花相關的種子油QTL（圖3b），表明B1基因座可能對種子油含量具有多效性作用。據(jù)推測，與非轉基因對照相比，來自兩個獨立事件的大豆p35S：CDSB1轉基因種子均顯示出種子油含量顯著降低（4.5％和6.9％）。種子油含量降低的水平似乎與轉基因的表達水平相關（圖2h）。與pB1：CDS-b1轉基因種子或非轉基因對照相比，擬南芥pB1：CDS-B1轉基因種子中的脂肪酸含量也顯著降低，但在pB1：b1-CDS轉基因種子和非轉基因對照之間未檢測到種子油含量的顯著差異（圖3d），表明（C到T）多態(tài)性是表型差異的原因。

圖4.?調控大豆脂肪酸生物合成的四個轉錄因子基因的表達水平和相互作用

為了闡明B1介導降低種子油含量的機制，分析了Williams 82發(fā)育豆莢、豆莢內果皮、種皮和種子中四種轉錄因子GmWRI1a，GmLEC1a，GmLEC1b和GmABI3b的表達水平。B1和PI 468916的T1轉基因植物在R5階段過表達。這些轉錄因子上調了大豆種子中脂肪酸的生物合成，其表達水平與種子油含量呈正相關。在B1的過表達下發(fā)育中的豆莢和豆莢果皮中四種轉錄因子的表達水平均顯著降低而在發(fā)育中的種皮和種子中未觀察（圖4a）。Williams 82和PI 468916之間的B1 / b1表達模式與之呼應（圖4b）。表明B1基因不影響大豆種子中脂肪酸的合成，是通過下調脂肪酸生物合成影響莢果（圖4c）。

總結

B1基因座對種皮開花和種子油含量均具有多效性，為進一步分離B1介導的兩個重要種子性狀的基因網(wǎng)絡奠定了基礎。盡管已經(jīng)在種群水平上對許多植物物種進行了測序和重測序，但有限數(shù)量的馴化相關基因，其中表型轉變的致病性突變已闡明。部分原因可能是由于基因-環(huán)境相互作用和各種基因-等位基因相互作用（包括多效性）決定了馴養(yǎng)綜合征的復雜性。最近的一項研究表明，在非洲水稻馴化過程中人為選擇SHATTERING 4的無意義突變會導致不破粒但顆粒尺寸較小。多效性并不總是對古代和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有利。

英文題目：Genomic introgression through interspecific hybridization counteracts genetic bottleneck during soybean domestication
中文題目：通過種間雜交實現(xiàn)基因組滲入抵消了大豆馴化過程中的遺傳瓶頸
發(fā)表期刊：Genome Biology
影響因子：14.028
發(fā)表時間：2019年1月30日

研究背景

已有文獻證明通過自發(fā)雜交和回交，農(nóng)作物及其野生近緣種之間有滲入，是遺傳物質轉移的證據(jù)。而對滲入的進化模式、后果及其對作物馴化、品種多樣化過程的影響知之甚少。種間雜交都有什么實例？本篇文章為您解析。

大豆(Glycine max?[L.] Merr.)是世界上最重要的經(jīng)濟作物之一，為飼料、食品及工業(yè)用途的植物油、燃料提供了高質量蛋白質來源。栽培大豆起源于中國，在距今約6000至9000年前由野生大豆(Glycine soja)馴化而來，之后進行了品種多樣化，形成許多適合于不同生態(tài)區(qū)域在農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中種植的大豆地方品種。盡管單一來源模型已被普遍接受，但大豆的馴化歷史和過程仍不清楚。一項早期研究提出，從野生大豆到馴化大豆的過渡是一個漸進過程。在中國的大豆種植區(qū)仍存在形態(tài)介于野生大豆與馴化大豆間的半野生型大豆(Glycine gracilis)。由此推測從野生大豆到栽培大豆可能存在基因流。

雜交產(chǎn)生的基因組片段滲入是基因流的主要途徑，在玉米和水稻種均報道存在基因滲入情況，但少有研究調查作物馴化期間基因組滲入的過程、模式和進化結果。

技術路線

研究結果

全基因組鑒定的野生大豆-栽培大豆基因滲入

通過302份已公布的大豆種質進行同源遺傳關系分析 (Identical By Descent，IBD), 發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)大豆均存在種間基因滲入片段。各個基因組（包括62個野生種和129個地方種）中檢測到的滲入片段的比例在0.00037至0.60之間，平均為0.032（圖1）。

圖2顯示了檢測到的基因滲入在各個基因組中具有> 5％滲入片段的種質的染色體分布。在野生大豆基因組中，檢測到栽培大豆片段的比例為0.00059至0.41，平均為0.019。在栽培大豆基因組中，檢測到野生大豆片段比例為0.00037至0.60，平均為0.031。野生大豆和栽培大豆亞群中，基因滲入片段的43.94％和54.61％由兩個或更多的種質共享，其余的是種質特異性的。滲入片段均未完全固定在野生大豆或栽培大豆中（圖2）。

具有推定基因滲入?yún)^(qū)域的D統(tǒng)計量顯著低于沒有推定基因滲入?yún)^(qū)域，并且也顯著低于全基因組平均水平，這表明野生大豆和栽培大豆間的基因流與這些基因區(qū)域有關（圖3）。

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圖1?野生大豆和栽培大豆的進化樹

圖2?種間基因滲入在全基因組的分布

環(huán)形從外至內依次表示(i)染色體臂(灰色)，近著絲粒區(qū)(綠色) (ii)群體水平的基因滲入比例在各條染色體的分布(iii)馴化相關QTL位點在各條染色體的分布(紅色) (iv)選擇掃蕩區(qū)域在各條染色體的分布(紅色) (v)具有代表性的12份栽培大豆及10份野生大豆材料基因滲入?yún)^(qū)間的在各條染色體的分布：栽培大豆片段(藍色)，野生大豆片段(橙色)

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圖3?D-statistic 分析方法展示野生和栽培大豆間基因組不同區(qū)域中不同模式的基因流

為了檢測到基因滲入的起源，比較了野生品種（PI 578357，s61）和地方品種（PI 339734，m30）中的代表性大滲入片段，據(jù)估計分別有33％、31％的基因滲入片段具有其他種質的相應區(qū)域。圖4b說明了在野生種PI 578357（s61）中，與栽培種進化相鄰的野生種之一的全基因組推定性基因滲入。PI 578357中2號染色體的檢測區(qū)域與地方品種黑河小黃豆（m104）中的相應區(qū)域具有最高的序列相似性（圖4a，b，d，f ），而PI 578357的非滲入?yún)^(qū)與野生品種PI 522226（s5）的對應區(qū)域具有最高的相似性（圖4b，c，e，f）。地方品種PI 339734中19號染色體的滲入?yún)^(qū)域與野生大豆PI 407275（s42）中的相應區(qū)域具有最高的序列相似性（圖4h，i， k，l），PI 339734非滲入?yún)^(qū)與地方品種PI 548456（m111）對應區(qū)域具有最高的相似性（圖4g，h，j，l）。

根據(jù)基因序列分析，PI 578357和黑河小黃豆之間及PI 339734和PI 407275之間的分歧時間分別可追溯到約0.37和27萬年前（mya）。由于大豆的馴化發(fā)生在大約6000-9000年前，兩對（野生大豆-栽培大豆）品種之間所檢查的滲入?yún)^(qū)域的如此高的相似性應被視為野生大豆-栽培大豆?jié)B入的直接證據(jù)。

圖4?基于同源遺傳關系分析推測的滲入片段起源的范例

(a-c)黑河小黃豆, PI 578357和PI 52226三個材料中基因組成分在2號染色體的分布(d)基于2號染色體基因滲入?yún)^(qū)域SNP構建的進化樹揭示的PI 578357中PI 52226成分的起源(e)基于2號染色體非基因滲入?yún)^(qū)域SNP構建的進化樹揭示的PI 578357中黑河小黃豆成分的起源(f)上述三個材料的地理分布(g-i) PI 548456, PI 339734和PI 407275三個材料中基因組成分在19號染色體的分布(j)基于19號染色體基因滲入?yún)^(qū)域SNP構建的進化樹揭示的PI 339734中PI 548546成分的起源(k)基于19號染色體非基因滲入?yún)^(qū)域SNP構建的進化樹揭示的PI 339734中PI 407275成分的起源(l)上述三個材料的地理分布

野生大豆-栽培大豆基因滲入的影響因素

圖5?自然選擇與人工選擇下基因滲入的模式

(a)野生大豆中選擇掃蕩區(qū)段中野生大豆成分的比例(b)野生大豆中馴化相關QTL區(qū)段中野生大豆成分的比例(c)栽培大豆中選擇掃蕩區(qū)段中栽培大豆成分的比例(d)栽培大豆中馴化相關QTL區(qū)段中栽培大豆成分的比例

相較于在野生大豆種質中檢測到的基因組其他區(qū)域，與選擇性掃描區(qū)域相應區(qū)域中的栽培大豆片段比例顯著降低（圖5a）。相比之下，與栽培大豆基因組相比，選擇性掃除區(qū)中野生大豆片段在基因組其他區(qū)域的檢出率顯著降低（圖5c）。在栽培大豆或野生大豆相應馴化QTL區(qū)域中，滲入片段比例比選擇性掃描區(qū)域中檢測到的?。▓D5b，d）。這些結果表明雙向選擇，即自然選擇與人工選擇，對野生大豆和栽培大豆中滲入片段的保留具有不同的結果、影響。

關鍵馴化基因周圍的基因流

圖6?基于兩個馴化相關基因所在的選擇掃蕩區(qū)段SNP信息構建的進化樹

基因滲入被認為是基因流的主要途徑，那么基因流如何在種群水平上影響馴化過程和大豆基因組的遺傳結構？現(xiàn)有研究已分離出分別控制種子硬度和種皮開花的關鍵大豆馴化基因GmHs1-1和Bloom1（B1），圍繞GmHS1-1、Gmhs1-1和B1、b1基因座的兩個選擇性掃除區(qū)域中的SNP分析系統(tǒng)發(fā)育關系發(fā)現(xiàn)基因滲入現(xiàn)象在這兩個區(qū)域均有存在。考慮到野生大豆和栽培大豆亞種的系統(tǒng)發(fā)育差異，在研究種群中兩個馴化基因位點檢測到的選擇性掃描區(qū)域和單倍型的混合將被視為亞種群間基因流動的進一步證據(jù)。

核基因組和細胞器基因組之間的不對稱多樣化揭示了基因滲入

圖7?栽培大豆和野生大豆核基因組和葉綠體基因組的非對稱分歧

191個材料的核基因組進化樹基于全基因組的SNP信息，葉綠體進化樹基于333個高度可信SNP位點。栽培大豆用藍色分枝藍色背景表示，野生大豆用紅色分枝紅色背景表示。兩個進化樹中的相同材料用直線連接。藍線表示栽培大豆中含有野生大豆葉綠體成分，橙線表示野生大豆中含有栽培大豆葉綠體成分?；揖€表示分別具有野生大豆和栽培大豆葉綠體的種質。

栽培大豆比野生大豆的葉綠體進化分化程度更小，但有些栽培大豆中含有野生大豆的葉綠體基因組，有些野生大豆中含有栽培大豆的葉綠體基因組（圖7）。說明野生大豆與栽培大豆之間存在雜交事件，這種雜交事件很可能是豐富的遺傳多樣性的原因。核基因組與葉綠體基因組總體上呈現(xiàn)出共進化趨勢，但部分細胞核與葉綠體基因組間發(fā)生了非平行進化，或許是由于種內天然雜交。

選擇抗?jié)B入的后果

圖8?大豆馴化過程模型

在大豆馴化期間或之后，種間雜交和隨后的回交產(chǎn)生廣泛的基因組滲入。之后通過從QTL或大豆馴化基礎的選擇清除區(qū)域清除滲入的變異，對DRT（馴化相關基因）進行重新選擇或輪回選擇（圖8）。在這些區(qū)域中觀察到的野生大豆?jié)B入片段的比例明顯低于地方品種的其余基因組區(qū)域。該模式與野生大豆種質中假定的漸滲的栽培大豆片段的分布模式相呼應，表明種間漸滲的進化命運由兩個不同選擇壓力的相對強度決定。作物馴化伴隨著遺傳多樣性的大量丟失，是作物形成中的主要遺傳瓶頸。但與野生大豆相比，栽培大豆中依然存在著較高的遺傳多樣性。據(jù)此估算，栽培大豆個體間的平均分化時間可追溯到30萬年前，而這樣高的多樣性通常是無法通過對某個地域中少數(shù)野生材料的人工選擇而獲得的。

結論

本研究揭示了農(nóng)作物及其野生近緣種之間假定的基因組基因滲入的進化力、模式和后果，以及滲入對作物馴化和品種多樣化過程的影響。設想種間滲入是抵消馴化作物特別是單種馴化作物遺傳多樣性減少的重要機制。

實驗材料

大豆“Taiwan 75”培養(yǎng)在正常條件下，第一真葉期的幼苗分為對照組和處理組。對照組—25°C（12h），17°C（12h），處理組—4°C（24h）。設置3次生物學重復。

研究結果

1.sRNA測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計
首先，對大豆4°C處理組（3h、6h、9h、12h、24h和36h）及對照組進行相對生長速率（RGR）和MDA含量的檢測。發(fā)現(xiàn)在24h時，對照組和處理組RGR和MDA含量明顯不同。因此，選擇冷脅迫24h進行sRNA測序。

對照組和處理組分別獲得6559098和8273245 clean reads。長度為21nt所占比例*高（圖1A）。非冗余的reads，長度分布統(tǒng)計可以看出24nt所占比例*高，在對照組和處理組中分別為68.4%和59%（圖1B）。

圖1.sRNA長度分布圖

2.鑒定大豆中已知的miRNA
共鑒定到已知的434個miRNA，屬于133個家族。這些miRNA包括保守miRNA和種間特異性miRNA。保守miRNA在植物發(fā)育過程和響應脅迫上起到重要作用。通過同源比對鑒定大豆中保守的miRNA家族。例如miR156，miR160，miR164等在很多植物物種中都是高度保守的。此外，找到一些非保守miRNA，例如miR3522,表明他們可能參與大豆的物種進化。

3.預測大豆中新的miRNA
根據(jù)miRNAs前體的發(fā)夾結構來預測miRNAs，找到3個預測的miRNA并鑒定折疊成的二級結構。

4.驗證大豆中預測的miRNA
為了驗證測序結果，利用qRT-PCR分析miRNA表達情況。選擇了35個miRNA（33個已知miRNA，2個預測miRNA）進行qRT-PCR分析。線性回歸分析測序結果和qRT-PCR結果相關性系數(shù)為0.8048，表明miRNA-Seq和qRT-PCR結果相一致。盡管miRNA-Seq和qRT-PCR結果在√確的倍數(shù)方面有些差異，這可能是由于2種實驗結果敏感性和特異性的不同導致的，但是miRNA表達趨勢是一致的。

圖2.qRT-PCR結果

5.miRNA靶基因鑒定
利用降解組測序鑒定miRNA降解的靶基因。共獲得12283683條raw reads，2623291條非冗余raw reads。共鑒定到898個轉錄本是54個miRNA家族的靶基因。本研究發(fā)現(xiàn)miRNAs可以降解2個甚至更多的靶基因，與之前的研究相似。例如，gma-miRNAs可以沉默屬于SBP家族的15個基因，脫落酸響應結合因素蛋白家族和2個基因，2個轉錄因子等。而且，有7個轉錄本受到多個miRNAs的調控。

6.鑒定大豆冷脅迫下相關的miRNA
對miRNA進行差異表達分析，共鑒定到32個miRNA家族的51個miRNA差異表達。在冷脅迫下有30個下調表達，21個上調表達。

對相應靶基因進行功能注釋來研究差異表達的miRNA可能行使的功能。差異表達的miRNA可以分為四類。第一類包括miRNA家族（miR156、miR164、miR169、miR4412和miR5327），靶基因為轉錄因子SBP、NAC、NFY、GRAS和bHLH，參與調控基因表達和信號傳導。第二類包括miR4411，其對應靶基因涉及抵御疾病。第三類包括miR5761、miR159、miR5667、miR1535、miR511、miR4382和miR4416，其對應靶基因參與植物生長發(fā)育中的適應性。為了進一步確認冷脅迫下miRNA和靶基因的關系，選擇了5個miRNAs及其靶基因進行qRT-PCR驗證。結果表明，在冷脅迫下miRNA-164a，miRNA-4411和miRNA-169e上調。相反的，他們的靶基因NAC、DRP和NFY顯著下調。說明miRNA和對應靶基因呈負相關性。

圖3.miRNA和對應靶基因qRT-PCR圖

為了近一步確認這些差異表達miRNA的功能，對靶基因進行GO分析。靶基因共參與了56個分子功能terms，37個生物學過程terms和7個細胞組分terms。在分子功能分類下，ATP結合、蛋白結合、組蛋白結合等terms是顯著富集的。超過35%miRNAs的靶基因參與了生物學過程途徑。

圖4.GO注釋

結 論

首次研究大豆冷脅迫下miRNA調控基因表達情況。利用降解組測序鑒定到了上百個靶基因，揭示miRNAs和靶基因之前的相互關系。盡管miRNAs調控機制十分復雜，目前還不是十分清楚，本次研究完善了miRNA數(shù)據(jù)庫，為研究大豆和其他物種的基因調控網(wǎng)絡提供了重要基礎。也發(fā)現(xiàn)了51個響應冷脅迫的miRNAs。

文章亮點

1.處理時間點的選擇上進行了預實驗，設置多個時間梯度進行處理并進行生理指標測定，最終選擇變化較為明顯的時期。選樣時間點有理有據(jù)。
2.利用降解組測序z確鑒定miRNA降解的mRNA。

參考文獻
[1] Xu S, Liu N, Mao W, et al. Identification of chilling-responsive microRNAs and their targets in vegetable soybean (Glycine max L.)[J]. Scientific Reports, 2016, 6.